細胞冷凍保存

冷凍保存方法分類

　　(1)傳統方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

　　(2)程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

冷凍保存方法步驟

　　(1)冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。

　　(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5～10%，混合均勻，置于室溫下待用。

　　(3)依細胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。

　　(4)離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。

注意事項

　　(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80–90%致密度。

　　(2)冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

　　(3)注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micron　FGLP　Telflon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

　　(4)冷凍保存之細胞濃度：

　　①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml

　?、趆ybridoma：1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。

　?、踑dherent tumor lines：5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml。

　?、躱ther suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。

　　(5)冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。

冷凍細胞活化

　　1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。

　　2、細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質)。

　　3、材料：37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器。

細胞解凍步驟

　　(1)操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

　　(2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。

　　(3)將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。

　　(4)取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。

　　(5)取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(稀釋比例為1：10～1：15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。

　　(6)解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

　　(7)若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。